密度梯度离心法收集逆行射精患者尿液中精子用于人工授精

　　逆行射精是引起男性不育的原因之一，临床上较为少见，其诊断要点是能正常房事且房事持续时间正常，有射精动作、快感及高潮，但无精液射出，房事后在尿中可查到精子和果糖等[1]。目前，包括人工授精、卵胞浆内单精子注射等多种方法已经成功应用于逆行射精所致男性不育症的治疗[2]，而如何收集逆行射精患者尿液中的精子已经成为这些治疗方法中的一个关键环节。近年来，我们采用密度梯度离心法收集逆行射精患者尿液中的精子用于人工授精，取得了较好的效果，现报告如下。

　　1 资料与方法

　　1.1临床资料2008年7月～2010年12月期间在安阳市妇幼保健院男性科和安阳市患者医院泌尿外科因男性不育就诊、经体格检查和彩色多普勒超声检查均无异常发现并符合上述逆行射精诊断要点的患者共5例。这5例患者大致年龄为23～29岁，婚后不育年限为2～8年，其中4例患者否认有外伤、手术史，无服用抗精神病、抗高血压药物史，分析为原发性逆行射精;1例既往曾生育1女婴，后因腰骶部外伤1年后渐续造成房事后无精液射出，分析为继发性逆行射精。5例患者曾在外院断续服用盐酸麻黄素、丙咪嗪、左旋多巴以及中草药等，服用方法和剂量不详，未见明显。患者配偶大致年龄为21～29岁，妇科B超检查均正常，月经规律，无排卵障碍，子宫输卵管碘油造影提示双侧输卵管通畅，相关免疫抗体检查均为阴性。

　　1.2 方 法

　　1.2.1试剂的准备取1个一次性无菌圆底试管，加入3ml Q-HTF精子洗液(美ZDL公司产品)置于37℃、5%CO2培养箱平衡过夜;用G-IVFTM-plus精子处理和受精液(瑞典Vitrolife公司产品)分别稀释Sperm GradTM-30精子梯度液(瑞典Vitrolife公司产品)浓度为45%和90%，于授精日当天，用无菌巴士德吸管吸取1ml 45%Sperm GradTM-30精子梯度液加入到1个一次性无菌尖底离心试管内，再用无菌巴士德吸管吸取1ml 90%Sperm GradTM-30精子梯度液缓慢加入到45% Sperm GradTM-30精子梯度液的下层，然后置于37℃、5%CO2培养箱中备用。

　　1.2.2患者的准备嘱患者戒烟酒及辛辣食物，近期内避免患高热等疾病，排卵期前禁欲5～7天。在女性排卵期前3日开始低蛋白饮食，并服用小苏打片，每日1g，以碱化尿液。授精日，一次性口服小苏打片3g，并嘱患者多喝水，1小时后每30min用精密pH试纸条测试患者尿液酸碱度，直至尿液呈碱性为止。嘱患者排净小便，手淫取精，当有性快感及高潮但无精液射出时，立即排小便于一次性无毒无菌取精杯内。

　　1.2.3收集精子将取精杯内的尿液视量的多少转入1～2个无菌尖底离心试管内，立即以1000rpm的转速离心5min，搜集沉淀物并加入2 ml 37℃、5%CO2培养箱平衡过的Q-HTF精子洗液充分混匀，镜下观察并记录精子密度、活力及成活率等精子主要参数后再缓慢转入到90%、45%双层Sperm GradTM-30精子密度梯度离心液的上层，以1500rpm的转速离心10min，弃上清，向沉淀物内加入数滴Q-HTF精子洗液混匀，使终体积为0.3～0.5 ml，即制成密度较高、活力较好的精子悬液，镜下观察并记录上述精子主要参数后放于37℃、5%CO2培养箱中待行人工授精。

　　1.2.4人工授精患者配偶均采用自然周期，B超动态监测卵泡发育以及子宫内膜的厚度，查看宫颈黏液情况，当优势卵泡直径达18mm以上、子宫内膜出现三线征、尿促黄体生成素呈阳性时，适时将收集、处理好的精子进行宫腔内人工授精，术毕抬高臀部仰卧2h。我们一般采用在排卵前做一次人工授精，部分患者在排卵前与排卵后各做一次人工授精。

　　2 结果

　　5例逆行射精患者中，1例患者在采用本方法处理精子后1个人工授精周期内配偶便成功妊娠，现已足月分娩;1例患者在采用本方法处理精子后3个周期内分别施行3次人工授精后配偶成功妊娠，也已足月分娩;1例患者在采用本方法处理精子后3个周期内共施行5次人工授精后，配偶现已获得临床妊娠;2例患者在采用本方法处理精子后分别在3个周期内共施行9次人工授精后配偶均未获得妊娠，建议患者改行卵胞浆内单精子注射治疗。5例患者尿液中精子在经过密度梯度离心法处理前后精子主要参数变化以及治疗结局见表1，其中采用多个周期、多次尿液中精子回收及人工授精治疗者以观察记录较高的数据为准。

　　3 讨论

　　逆行射精病因较多，治疗方法不一，解决逆行射精患者的生育问题是治疗逆行射精的主要目的[3,4]，人工授精、卵胞浆内单精子注射等方法逐渐得到广泛应用，其中，已有多种方法用于收集逆行射精患者尿液中的精子[5]。本文探讨了密度梯度离心法收集逆行射精患者尿液中的精子用于人工授精的治疗情况。

　　已知密度梯度离心法和上游法是精子体外处理常用的两种方法，密度梯度离心法比上游法具有精子回收率高的优点[6]。逆行射精患者尿液中的精子与顺行射精排出的精子相比一般密度偏低，成活率低，活力差。为了提高妊娠率，我们采用密度梯度离心法收集患者尿液中的精子，试图通过回收尽可能多的活精子，增加向宫腔内注入活精子的数量来得到妊娠的目的。我们的临床实践表明，5例逆行射精患者先后经过13个周期共18次尿液中精子收集和配偶人工授精后，有3例患者的配偶达到临床妊娠并有2例分娩，累积临床妊娠率为60%(3/5)。从表内数据看，在排除女方因素外，人工授精能否成功，一方面与逆行射精患者尿液中精子的基础状况有关;另一方面与密度梯度离心法的处理效果也有很大关系。尽管我们采用多个周期并且在同一排卵周期内，围绕排卵前与排卵后各做1次人工授精，仍然有2例患者的配偶未能妊娠，而这2例患者尿液中的精子主要表现为少、弱精子症。经验表明，对这些尿液中表现为严重少、弱精子症的逆行射精患者，应嘱患者尽早实施卵胞浆内单精子注射治疗，以免耽误患者治疗时间。

　　此外，我们在实际工作中发现，嘱患者低蛋白饮食、多饮水、碱化尿液是提高尿液中精子质量的重要因素，将尿液迅速离心后向沉淀物中加入培养液会很快改善精子的环境，同时减少了精子与尿液接触的时间，有利于得到质量较高的精子，否则，培养液中将会出现大量死精子而影响密度梯度离心法的处理效果。有作者事先采用膀胱冲洗的办法，期望改变膀胱内的环境来提高精子的质量[7]。然而，膀胱冲洗是一种侵入性操作，它不仅操作繁琐，无形中增加患者的心理压力，而且也有导致上行感染的可能，故我们摈弃了以往采用的这种方法。也有作者采用嘱患者射精后直接将尿液排入培养液中[8,9]，我们在实践中发现，一方面，患者射精后的尿液量很难把握，有时尿量会差别很大;另一方面，患者直接接触培养液有增加污染的可能性，基于此，另有作者主张配偶适当应用抗生素以预防宫腔内感染[10]。相比较而言，采用密度梯度离心法收集逆行射精患者尿液中的精子实施人工授精，方法简单、快捷有效，值得推荐。